人细胞凋亡酶联免疫检测(ELISA)
试剂盒使用说明书
- 仅用于科研，不得用于临床诊断！
- 用于定量检测人血清、血浆及其他相关液体样本中细胞凋亡的含量。
- 有效期：6个月。
- 保存条件：2-8℃
使用前请仔细阅读说明书！
实验原理：
本试剂盒应用生物素双抗体夹心法测定样品中人细胞凋亡水平。向预先包被了人细胞凋亡单克隆抗体的酶标孔中加入细胞凋亡，温育；温育后，加入生物素标记的抗细胞凋亡抗体。再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的细胞凋亡呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人细胞凋亡的浓度。
试剂盒组成
试剂盒组成： | 48孔配置 | 96孔配置 |
说明书 | 1份 | 1份 |
封板膜 | 2片（48） | 2片（96） |
密封袋 | 1个 | 1个 |
酶标包被板 | 1×48 | 1×96 |
标准品：32ng/ml | 0.5ml×1瓶 | 0.5ml×1瓶 |
标准品稀释液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 |
链霉亲和素-HRP | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 |
生物素标记的抗Apoptosis抗体 | 0.5ml×1瓶 | 1 ml×1瓶 |
显色剂A液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 |
显色剂B液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 |
终止液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 |
浓缩洗涤液 | （20ml×20倍）×1瓶 | （20ml×30倍）×1瓶 |
注意事项：
- 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
- 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
- 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
- 请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔*孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请zui后乘以总稀释倍数（×n）。
- 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
- 底物请避光保存。
- 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
- 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
- 本试剂不同批号组分不得混用。
需要而未提供的试剂和器材：
- 37℃恒温箱。
- 标准规格酶标仪。
- 精密移液器及一次性吸头
- 蒸馏水，
- 一次性试管
- 吸水纸
样本处理及要求：
1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。。
操作程序
- 标准品的稀释：(本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。)
16ng/ml | 5号标准品 | 150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液 |
8 ng/ml | 4号标准品 | 150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液 |
4 ng/ml | 3号标准品 | 150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液 |
2ng/ml | 2号标准品 | 150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液 |
1 ng/ml | 1号标准品 | 150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液 |
- 根据代测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。
- 将稀释好的标准品按照浓度由高到低或者由低到高依次加入酶标包被板孔中。
- 分别设空白孔（空白对照孔不加样品、生物素标记的抗Apoptosis抗体及链霉亲和素-HRP，其余各步操作相同）及待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品40μl，然后再加生物素标记的抗Apoptosis抗体10μl。加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
- 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
- 配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。
- 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
- 加酶：每孔加入链霉亲和素-HRP 50μl，空白孔除外。
- 温育：操作同5。
- 洗涤：操作同7。
- 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
- 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
- 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。
实验操作流程图：
计 算：
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标 准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释
倍数，即为样品的实际浓度。
