HiFi-MMLV cDNAdi一链合成试剂盒
HiFi-MMLV cDNA Kit
目录号：K0744
保存条件：-20℃保存。
组分说明
组分说明
Cat. No. K0744 K0744A
Kit Size 25 100
HiFi-MMLV，200 U/μl 25 μl 100 μl
5×RT Buffer 120 μl 500 μl
Primer Mix 60 μl 240 μl
dNTP Mix，2.5 mM Each 120 μl 500 μl
DTT，0.1 M 60 μl 240 μl
RNase-Free Water 1 ml 1 ml
本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及其他用途
产品简介
本产品是专为两步法RT-PCRdi一步实验配制的cDNAdi一链合成试剂盒。本产品包
含从RNA模板逆转录成cDNAdi一链所需的所有试剂，其中包括HiFi-MMLV逆转录酶、
反应缓冲液、引物、dNTP等。经过突变改造的HiFi-MMLV逆转录酶RNase H活性缺失，
减少了逆转录反应中RNA的降解，更容易获得全长的cDNA。HiFi-MMLV逆转录酶热稳
定性强，可得高产量的 cDNA，使用简单方便。本系统对后续的 PCR以及定量PCR试
验兼容性高，适用各种PCR反应的DNA聚合酶。
产品特点
·RNase H-：经突变的HiFi-MMLV逆转录酶，RNase H活性缺失，更易获得全长cDNA。
·使用方便：试剂盒包含除RNA模板外的逆转录所需全部试剂。
注意事项
1．在操作过程中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染，建议在专门
的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经
常更换手套。
2．实验尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，应使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙
酯）水溶液在37℃处理12小时，并在120℃下高压灭菌30分钟后使用，或者将玻璃
器皿在180℃下干热灭菌60分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用 0.1%的DEPC
处理后进行高压灭菌。
3．本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心
后使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃，避免反复冻融。
4．若起始RNA的量小于50 ng，建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）。本试剂盒并未提
供，如需要可单独向本公司订购，货号：YJ0596。
使用方法
注意：10 ng-5 μg总RNA可建立20 μl反应体系，如果总RNA量大于5 μg，请按比例扩大反应体系。
i逆转录操作步骤：
1．将RNA模板、引物、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFi-MMLV和RNase-Free Water
溶解并置于冰上备用。
2．根据以下表格配制反应体系，总体积为20 μl。
试剂 20 μl反应体系 终浓度
dNTP Mix，2.5 mM Each 4μl 500 μM Each
Primer Mix 2μl
RNA Template Xμl 1 ng-5 µg
5×RT Buffer 4μl 1×
DTT，0.1 M 2μl 10 mM
HiFi-MMLV，200 U/μl 1 μl
RNase-Free Water up to 20 μl
注意：1）若起始RNA的量小于50 ng，则建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）。本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购，货号：K0596。
2）Primer Mix由Oligo(dT)和Random Primer配制而成。
3．涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
4．42℃孵育30-50分钟，85℃孵育5分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
5．逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，或置于-20℃长期保存。
ii 若逆转录效率低，或RNA模板二级结构复杂、GC含量高时，建议采用以下步骤：
1．将RNA模板、引物、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFi-MMLV和RNase-Free Water
溶解并置于冰上备用。
2．根据以下表格配制反应体系，总体积为13 μl。
试剂 20 μl反应体系 终浓度
dNTP Mix，2.5 mM Each 4 μl 500 μM Each
Primer Mix 2 μl
RNA Template X μl 1 ng-5 µg
RNase-Free Water up to 13 μl
3．70℃孵育10分钟，迅速冰浴2分钟。
4．短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
5．继续向以上反应液中加入以下试剂：
试剂 20 μl反应体系 终浓度
5×RT Buffer 4 μl 1×
DTT，0.1 M 2 μl 10 mM
注意：1）若起始RNA的量小于50 ng，则建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）。本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购，货号：YJ0596。
2）Primer Mix由Oligo（dT）和Random primer配制而成。
6．轻轻吹打混匀，42℃孵育2分钟。
7．加入1 μl HiFi-MMLV（200 U/μl），轻轻吸打混匀。42℃孵育50分钟。
8．85℃孵育5分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
9．逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，或置于-20℃长期保存。
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