HiFiScript cDNA第--链合成试剂盒说明书
HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit
HiFiScript cDNA第--链合成试剂盒
目录号：K2569
保存条件：-20℃保存。
组分说明
Size 25 100
HiFiScript，200 U/μl 25 μl 100 μl
5×RT Buffer 120 μl 500 μl
Primer Mix 60 μl 240 μl
dNTP Mix，2.5 mM Each 120 μl 500 μl
DTT，0.1 M 60 μl 240 μl
RNase-Free Water 1 ml 1 ml
本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及其他用途
产品简介
本产品是专为两步法RT-PCR第--步实验配制的cDNA第--链合成试剂盒。该试剂盒中使用的HiFiScript逆转录酶是M-MLV由来的新型高效逆转录酶，新颖突变位点大幅提升酶的转录活性， cDNA第--链合成的效率和产量更高，可利用 pg级的总 RNA或mRNA合成cDNA第--链。点突变消除RNase H活性，酶的延伸性能提高，有效改善逆转录酶与RNA模板的亲和力，可获得长至12 kb的cDNA。精心优化的RT Buffer使逆转录酶应用范围更广，对后续的 PCR以及定量PCR实验兼容性高。该试剂盒配备所有逆转录试剂，使用简单方便。适用于第--链cDNA的合成和后续的RT-PCR、RT-qPCR，以及全长cDNA文库的构建等。
产品特点
1．高效的逆转录效率：新颖突变位点大幅提升酶活性能，获得更高产量的cDNA。
2．良好的延伸能力：点突变消除RNase H活性，改善逆转录酶与RNA模板的亲和力，可获得长至12 kb的cDNA。
3．灵敏度高：可利用pg级的总RNA或mRNA模板合成cDNA第--链。
4．使用方便：逆转录试剂盒中已配备所有逆转录试剂，仅需准备模板即可轻松完成逆转录。
注意事项
1．在操作过程中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染，建议在专门的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套。
2．实验尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，应使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃处理12小时，并在120℃下高压灭菌30分钟后使用，或者将玻璃器皿在180℃下干热灭菌60分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用 0.1%的DEPC处理后进行高压灭菌。
3．本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃，避免反复冻融。
4．若起始RNA的量小于50 ng，建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）。本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购，货号：K0596。
使用方法
注意：1 ng-5 μg总RNA可建立20 μl反应体系，如果总RNA量大于5 μg，请按比例扩大反应体系。
逆转录操作步骤：
1．将RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFiScript和RNase-Free
Water溶解并置于冰上备用。
2．根据以下表格配制反应体系，总体积为20 μl。
试剂 20 μl反应体系 终浓度
dNTP Mix，2.5 mM Each 4 μl 500 μM Each
Primer Mix 2 μl
RNA Template X μl 50 pg-5μg
5×RT Buffer 4 μl 1×
DTT，0.1 M 2 μl 10 mM
HiFiScript，200 U/μl 1 μl
RNase-Free Water up to 20 μl
注意：1）若起始RNA的量小于50 ng，则建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）。本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购，货号：K0596。
2）Primer Mix由Oligo(dT)和Random Primer配制而成。
3．涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
4．42℃孵育30-50分钟，85℃孵育5分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
5．逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，或置于-20℃长期保存。
ii 若逆转录效率低，或RNA模板二级结构复杂、GC含量高时，建议采用以下步骤：
1．将RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFiScript和RNase-Free
Water溶解并置于冰上备用。
2．根据以下表格配制反应体系，总体积为13 μl。
试剂 20 μl反应体系 终浓度
dNTP Mix，2.5 mM Each 4 μl 500 μM Each
Primer Mix 2 μl
RNA Template X μl 50 pg-5μg
RNase-Free Water up to 13 μl
3．70℃孵育10分钟，迅速冰浴2分钟。
4．短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
5．继续向以上反应液中加入以下试剂：
试剂 20 μl反应体系 终浓度
5×RT Buffer 4 μl 1×
DTT，0.1 M 2 μl 10 mM
注意：1）若起始RNA的量小于50 ng，则建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）。本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购，货号：K0596。
2）Primer Mix由Oligo（dT）和Random primer配制而成。
6．轻轻吹打混匀，42℃孵育2分钟。
7．加入1 μl HiFiScript（200 U/μl），轻轻吸打混匀。42℃孵育50分钟。
8．85℃孵育5分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
9．逆转录产物可直接用于 PCR反应和荧光定量 PCR反应，加入量应小于 PCR反应体系的1/10，或置于-20℃长期保存。
