植物RNA提取试剂盒（DNase I）说明书

RNApure Plant Kit（DNase I）

植物 RNA 提取试剂盒（DNase I）说明书

Cat. No.   K0559

保存：DNase I、10×Reaction Buffer：-20  ℃

其它组分：室  温

组分说明

                                              Cat No.               K0559

                                              Kit Size                 50

                                              DNase I                1000 U

                                        10×Reaction Buffer           1000  μl

                                             Buffer RL               35 ml

                                            Buffer RLC               35 ml

                                            Buffer RW1               40 ml

                                    Buffer RW2（concentrate）          11 ml

                                        RNase-Free Water             10 ml

                                      Shredder Spin Column             50

                                         Spin Columns RM               50

                                    Collection Tube（1.5 ml）            50

                                     Collection Tube（2 ml）            100

产品简介

    本试剂盒用于从各种植物中提取纯化高品质总 RNA，也适用于真菌菌丝 RNA 的提取。*的 Shredder 分离柱，用于

匀质化和过滤高粘度的植物或真菌裂解物，同时采用硅基质膜吸附 RNA 进行纯化，使多聚糖等各种污染物通过洗涤被有效

去除，经洗脱的RNA可直接用于各种下游实验。由本试剂盒提取RNA分子量大于 200 碱基，纯度高，几乎无DNA残留。

如果是对微量 DNA 非常敏感的 RNA 实验，残留的 DNA 可利用无 RNase 的 DNase 在柱上进行消化去除。提取的 RNA

可用于 Northern Blot、Dot Blot 、RT-PCR 和体外翻译等实验。

注意事项

1.  预防RNase污染，应注意以下几方面：

    1）使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。

    2）玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水*冲洗后高压灭菌。

    3）配制溶液应使用无RNase的水。

    4）操作人员戴一次性kou'zhao和手套，实验过程中要勤换手套。

2.  提取的样品避免反复冻融，否则影响 RNA 提取的量和质量。

3.  Buffer RL 在使用前请加入β-巯基乙醇，1 ml Buffer RL 加 10 μl β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的 Buffer RL 室温可保存 1 个月。Buffer RLC 使用时不需加β-巯基乙醇。

4.  第-次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在 Buffer RW2 中加入无水乙醇。

5.  Buffer RL 和 Buffer RLC 如果产生沉淀，请加热使其溶解后室温放置。

6.  所有离心步骤均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。

自备试剂：β-巯基乙醇、无水乙醇（新开封或提取RNA）  

操作步骤

 1.   50-100 mg植物组织在液氮中迅速研磨成粉末，加入600 μl Buffer RL（使用前检查是否加入β-巯基乙醇）或Buffer RLC。涡旋振荡使其充分裂解。

 注意：1）Buffer RL主要成分为异硫氰酸胍，适用于大多数植物组织的裂解。但有些植物组织（如玉米的胚乳），由于次级代谢产物较特殊，异硫氰酸胍使样品产生沉淀，导致RNA提取效果不佳，此时可加入Buffer RLC替代Buffer RL。

 2）56℃孵育1-3分钟有助于组织的裂解，但是淀粉含量高的植物不要进行高温孵育。

 2.   将步骤1所得全部液体转移至已装入RNase-Free 2 ml收集管（RNase-Free 2 ml Collection Tube）的Shredder Spin Column中，12,000 rpm（~13,400×g）离心2分钟，将收集管中的上清液转移到一个新的离心管（自备）中。

注意：1）在吸取液体时可以将枪头剪掉，便于取样。

2）Shredder Spin Column可以除去大部分的碎片，但仍会有小部分流出，离心后会在收集管内形成沉淀，在进行下一步时注意避免吸到沉淀。

 3.   在步骤2所得干净的裂解液中加入0.5倍体积的无水乙醇，迅速混匀。

注意：加入乙醇后可能会产生沉淀，但不影响后续试验。

 4.   将上步得到的溶液转移到吸附柱（Spin Columns RM）中（吸附柱已装入收集管中）,若一次不能将全部溶液加入吸附柱中，请分两次转入; 10,000 rpm（~8,000 x g）离心15秒，弃掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。

 5.   向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1，10,000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

 6.   配制DNase I  混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8  μl 10×Reaction Buffer 和20  μl DNase I（1U/μl），混匀，  配制成终体积为80 μl的反应液。

 7.   向吸附柱中直接加入80 µl DNase I  混合液，20-30℃孵育15分钟。

 8.   向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1, 10,000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

 9.   向吸附柱中加入500  μl Buffer RW2（使用前检查是否加入无水乙醇）, 10,000 rpm离心15秒,弃废液。

 10. 重复步骤9。

 11. 将吸附柱放回收集管中，12,000 rpm离心1分钟，将吸附柱置于室温数分钟，以*晾干。

     注意：这一步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。

 12. 将吸附柱装入新的RNase-Free 1.5 ml  收集管中，向吸附膜的中间加入30-50 μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，10,000 rpm离心1分钟，得到的RNA溶液保存在-70℃，防止降解。

 注意：1）  RNase-Free Water 体积不应小于 30 μl，体积过小影响回收率。

2）  如果要提高RNA的产量，可用30-50 μl新的RNase-Free Water重复步骤12。

3）  如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤12。

实验代做服务：