Nc-细胞核/浆蛋白抽提试剂盒说明书
Nuclear and Cytoplasmic Extraction Kit
目录号：K0199
保存：蛋白酶抑制剂混合物：-20℃
其它组分：2 - 8 度
组分说明
Catalog no. K0199B
Kit Size 50 次
Nc-试剂 A 50 ml
Nc-试剂 B 3 ml
Nc-试剂 C 25 ml
蛋白酶抑制剂混合物 750 μl
产品简介
Nc-细胞核/浆蛋白抽提试剂盒能够简单、快速的提取来源于哺乳动物细胞及组织的细胞核和细胞浆蛋白，所提取蛋白保持生物学活性。本试剂盒首先通过细胞浆蛋白抽提试剂裂解细胞膜，释放细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。后通过细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。抽提获得的核蛋白及浆蛋白纯度高，有效避免核/浆蛋白的交叉污染，可以用于Western、Gel Shift、报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。
注意事项
1. 如需提取磷酸化蛋白请在抽提试剂中加入磷酸酶抑制剂。
2. 所有样品操作请置于冰上进行。
3. 可根据具体实验情况调整试剂用量，保证各试剂使用比例为 Nc-试剂 A：Nc-试剂 B：Nc-试剂 C=100：5.5：50。
4. 可以采用更高的速度来离心。
5. 戴手套操作。
操作步骤
l 细胞中胞浆、胞核蛋白的提取
1. 收集细胞，计数。
2. 请在蛋白抽提前取出抽提试剂Nc-试剂A和Nc-试剂C进行预冷，按照1:99比例加入蛋白酶抑制剂混合物（例如990μ抽提试剂中加入10μl蛋白酶抑制剂混合物），使蛋白酶抑制剂混合物在抽提试剂中成1×工作液。
注意：在进行蛋白抽提前2-3分钟内加入蛋白酶抑制剂混合物。
3. 1×107细胞中加入1 ml Nc-试剂A（使用前加入蛋白酶抑制剂混合物）， 涡旋5秒以充分混匀，冰上孵育20分钟。
注意：各种细胞的特性不同，需要根据不同细胞的特性调整Nc-试剂A的用量，如果蛋白浓度小，按比例减少Nc-试剂A及后续Nc-试剂B、Nc-试剂C的用量。
4. 加入55 μl Nc-试剂 B，涡旋5秒以充分混匀，冰上孵育1分钟。
5. 4℃ 12,000 rpm（13,400×g）离心15分钟，收集上清（尽量收集干净上清液）至另一离心管中，-20℃保存待测（此提取液为胞浆蛋白）。
6. 向上步所得的沉淀中加入500μl Nc-试剂C（使用前加入蛋白酶抑制剂混合物）， 涡旋5秒以充分混匀，重悬沉淀，冰上孵育40分钟，每隔10分钟涡旋混匀一次，每次约15-30秒。
7. 4℃ 12,000 rpm离心15分钟，收集上清（尽量收集干净上清液）至另一离心管中，-20℃保存待测（此提取液为胞核蛋白）。 组织中胞浆、胞核蛋白的提取
1. 取材，保存组织。
2. 请在蛋白抽提前取出抽提试剂Nc-试剂A和Nc-试剂C进行预冷，按照1:99比例加入蛋白酶抑制剂混合物（例如990μl抽提试剂中加入10μl蛋白酶抑制剂混合物），使蛋白酶抑制剂混合物在抽提试剂中成1×工作液。
注意：在进行蛋白抽提前2-3分钟内加入蛋白酶抑制剂混合物。
3. 称组织重量，每100 mg组织中加入1 ml Nc-试剂A（使用前加入蛋白酶抑制剂混合物），用匀浆器在冰上充分匀浆，
放置在冰上孵育20分钟。
注意：各种组织的特性不同，需要根据不同组织调整Nc-试剂A的用量，如果蛋白浓度小，按比例减少Nc-试剂A及后续Nc-试剂B、Nc-试剂C
的用量。
4. 加入55μl Nc-试剂B，涡旋5秒以充分混匀，放置在冰上孵育 1分钟。
5. 4℃12,000 rpm（13,400×g）离心15分钟，收集上清（尽量收集干净上清液）至另一离心管中，-20℃保存待测（此提取液为胞浆蛋白）。
6. 向上步所得的沉淀中加入500μl Nc-试剂C（使用前加入蛋白酶抑制剂混合物）， 涡旋5秒以充分混匀，重悬沉淀，冰上孵育40分钟，每隔10分钟涡旋混匀一次，每次约15-30秒。
7. 4℃12,000 rpm离心15分钟，收集上清（尽量收集干净上清液）至另一离心管中，-20℃保存待测（此提取液为胞核蛋白）。
参考附表
表1. 常见问题及解决办法
问题 可能原因 解决方法
细胞未裂解 适量增加试剂的使用量
1细胞浆/核蛋白提取率低
细胞沉淀未充分悬浮 充分涡旋
未*收集细胞核 延长加入Nc-试剂 B 后的离心时间
2蛋白浓度低 未加入足量抽提试剂 调整试剂使用量
3蛋白无活性或 样本未置于4℃环境中 请于4℃离心，除涡旋外，保证样品置于冰上
活性过低 蛋白酶不*抑制 添加其它蛋白酶抑制剂
未*移走细胞浆蛋白裂解液裂解细胞核前，小心移走细胞浆蛋白裂解液
4细胞核及浆蛋白
未分开 未充分裂解细胞 增加涡旋时间确保收集的细胞充分悬浮
组织匀浆过度、不足或不均匀 优化匀浆条件
