β-兴奋*类

快速检测试剂盒说明书

一、原理

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的β-兴奋*类药物将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗β-兴奋*类药抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含β-兴奋*类药物的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应β-兴*剂类药物的含量。

二、试剂盒特性

• 试剂盒灵敏度：   0.1ppb
• 孵育温度：       25℃
• 孵育时间：       30min～15min
• 样本检测下限

猪   尿 ··········································  0.3ppb

猪   肉 ··········································  0.6ppb

• 交叉反应率

克伦特罗（Clenbuterol）·························  100%

西马特罗（Cimaterol）   ·······················  <4%  

溴布特罗（Brombuterol）   ······················  60%

马布特罗（Mabuterol）  ·························  108%

班布特罗（Bambuterol）  ······················   <5%

氯丙那林（Clorprenaline）  ·····················  <1%

沙丁胺醇（Salbutamol）  ·························  75%

特布他林（Terbutaline ）  ······················  25%

喷布特罗（Penbutolol）  ·························  19%

妥布特罗（Tulobuterol）  ························  23%

菲诺特罗（Fenoterol）  ····························<0.1%

莱克多巴胺（Ractopamine） ······················ <0.1%

• 样本回收率

猪 尿、猪 肉  ····························  90%±30%

三、试剂盒组成

四、所用仪器、试剂

具备的仪器：酶标仪、离心机、恒温箱、打印机

微量移液器：单道 20～200µl、单道100～1000µl、多道 30～300 µl

试      剂：氢氧化钠、浓盐酸

五、样本前处理步骤

• 样本处理前须知

（a）实验中必须使用一次性吸头，吸取不同试剂时要更换吸头。

   （b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

• 样本前处理需配制：

配液1   0.2M 盐酸

取 17.2ml 浓盐酸加去离子水定容至 1L。

配液2   1M 氢氧化钠

    称取4g 氢氧化钠固体加去离子水定溶至    

    100ml。

配液3   样本提取液

    5X样本提取液用去离子水1：4稀释。

• 样本处理：

（a）猪肉样本的处理方法

• 称取 2 ± 0.05g 均质后的组织于50ml离心管中，加入3ml 0.2M盐酸（见配液1），充分振荡3min。
• 再加入600ul 1M 氢氧化钠（见配液2）溶液和2.4ml 样本提取液（见配液3）溶液，充分振荡3min，室温4000r/min 以上离心10min。
• 取20 µl上层液体用于分析。（注：离心后若有脂肪层，去除脂肪层或拨开脂肪层，取清澈液体进行分析）。

样本稀释倍数：  4倍

（b）猪尿样本的处理方法

取20µl清亮尿样直接测定（如果尿样浑浊一定

要过滤或4000r/min离心10min，直至得到清亮

尿样），暂不使用的样本应冷冻保存。

样本稀释倍数:  1倍

六、 酶标免疫分析程序:

• 测定前应须知：

• 使用前将需用试剂和板条的温度回升至室温（20～25℃）。
• 使用之后立即将所有试剂放回2～8℃。
• 在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
• 所有恒温孵育过程，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。

• 操作步骤：

• 从2～8℃冷藏环境中取出所需试剂，室温（20～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
• 取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2～8℃。
• 配液：将 40ml浓缩洗涤液（20 倍浓缩）用去离子水按照 1：19 稀释（1 份浓缩洗涤液+19 份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。
• 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
• 加标准品/样本20µl/孔到各自的微孔中，加入酶标记物50µl/孔，然后加入80µl/孔的抗体工作液，用盖板膜盖板，轻轻振荡混匀，25℃环境反应30min。
• 将孔内液体甩干，用洗涤液250µl/孔洗板4～5次，每次间隔15～30秒，用吸水纸拍干（拍干后未清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
• 显色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。
• 测定：加入终止液50µl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，5min内读数），测定每孔OD值。

七、结果判定

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光度值与其所含β-*奋剂量成负相关。

1、粗略判定：

用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样本1的吸光度值为0.3，样本2的吸光度值为1.0，标准液吸光度值分别是：0ppb为2.243； 0.1ppb为1.816；0.3ppb为1.415；0.9ppb为0.74；2.7ppb为0.313；8.1ppb为0.155。则样本1的浓度范围是2.7ppb～8.1ppb；样本2的浓度范围是0.3ppb～0.9ppb，乘以其对应的稀释倍数即为样本中β-*奋剂类药物实际浓度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值（双孔）除以第--个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

（2）标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以β-*奋剂标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中β-兴奋*类药物实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。

八、 注意事项

• 室温低于25℃或试剂及标本未回到室温（20～25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
• 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
• 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。
• 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
• 不要使用过了有效日期的试剂盒；稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值变化；不要交换使用不同批号的盒中试剂。
• 不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
• 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。标准品1的吸光度值小于0.5时，表示试剂可能变质。
• 该试剂盒*佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

九、储藏条件和保质期

• 储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，不要冷冻。
• 保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。

提示：酶标板真空包装袋若有漏气，酶标板仍然正常有效，不影响实验结果，请放心使用。

实验代做服务：