动物组织/细胞RNA提取试剂盒（DNase I）说明书
RNApure Tissue Kit（DNase I）
动物组织/细胞RNA提取试剂盒（DNase I）
目录号：K0560
保存：DNase I、10×Reaction Buffer：-20℃
其它组分：室 温
组分说明
Cat.No. K0560
KitSize 50
DNaseI 1000U
10×ReactionBuffer 1000 μl
BufferRL 35ml
BufferRW1 40ml
BufferRW2（concentrate） 11ml
RNase-FreeWater 10ml
SpinColumnRM 50
CollectionTube（1.5ml） 50
CollectionTube（2ml） 50
产品简介
本试剂盒将高效的异硫氰酸胍裂解技术与硅基质膜纯化技术相结合，可从动物细胞及组织中高效提取总 RNA。起始样本一般多 30mg 组织或 1x107 细胞。本试剂盒还可回收未*纯化的 RNA、体外转录和酶促反应后得到的 RNA。用本试剂盒可提取纯化分子量大于 200 碱基的高品质 RNA，几乎无 DNA 残留。如果要进行对微量 DNA 非常敏感的 RNA 实验，残留的 DNA 可利用无 RNase 的 DNase 在柱上进行消化去除。提取的 RNA 可用于 RT-PCR、NothernBlot、DotBlot等下游实验。
注意事项
1. 预防RNase污染，应注意以下几方面：
1）使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
2）玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分钟，用水*冲洗后高压灭菌。
3）配制溶液应使用无RNase的水。
4）操作人员戴一次性*罩和手套，实验过程中要勤换手套。
2. 提取的样品避免反复冻融，否则影响 RNA 提取的量和质量。
3. BufferRL 在使用前请加入β-巯基乙醇，1mlBufferRL 加 10μl β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的 BufferRL 室温可保存1 个月。
4. 第-次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在 BufferRW2 中加入无水乙醇。
5. BufferRL 如果产生沉淀，可于 56℃加热使其溶解后室温放置。
6. 所有离心步骤均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。
自备试剂： β-巯基乙醇、无水乙醇（新开封或提取RNA）
操作步骤
1. 样品处理
1a. 组织：将组织在液氮中磨碎。每20-30 mg组织加600 μl Buffer RL（使用前检查是否加入β-巯基乙醇），组织样本少于20 mg加350 μl Buffer RL。样品体积不超过BufferRL体积的十分之一。
1b 单层培养细胞：将细胞在培养瓶中直接裂解或处理成细胞悬液，离心得到细胞沉淀，弃上清，每6-10 cm 2培养面积加入600 μl Buffer RL，小于6 cm2 加入350 μl Buffer RL，反复吹打几次，使其充分裂解。
1c. 细胞悬液：12,000rpm6（～13,400×g）离心1分钟弃上清，得到细胞沉淀。每5×106 -1×107 细胞加入600 μl Buffer RL ，少于5×106细胞加入350 μl Buffer RL，反复吹打几次，使其充分裂解。
注意：1）尽量除尽细胞培养基，细胞培养基可能抑制细胞的裂解影响RNA产量。
2）尽量使细胞充分悬浮并充分裂解，否则影响RNA产量。
2. 样品充分裂解后，室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物*分离。
3. 12000rpm离心2-5min，取上清进行以下操作。
4. 向步骤3中得到的溶液中加入1倍体积（600 μl 或350 μl）的70%乙醇（无RNase水配制），混匀。
注意：加入乙醇后可能会产生沉淀，不会影响后续实验。
5. 将上步所得溶液全部加入到吸附柱（SpinColumnRM）中（吸附柱已装入收集管CollectionTube中），若一次不能将全部溶液加入吸附柱中，请分两次转入，12,000rpm离心1分钟，弃废液。将吸附柱放回收集管中。
注意：吸附柱的大载量为100µg，不要超载，否则会影响RNA的产量和纯度。
6. 向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1，10,000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7. 配制DNaseI 混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8 μl 10×Reaction Buffer 和20 μl DNase I（1U/μl），混匀，配制成终体积为80 μl的反应液。
8. 向吸附柱中直接加入80 µl DNase I 混合液，20-30℃孵育15分钟。
9. 向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1，10,000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
10. 向吸附柱中加入500 μl Buffer RW2（使用前检查是否加入无水乙醇）,12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废
液，将吸附柱放回收集管中。
11. 重复步骤10。
12. 12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以*晾干。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR 等）。
13. 将吸附柱转入新的RNase-Free的1.5ml 收集管中，向吸附膜中间位置加入30-50 μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。
注意：1）RNase-FreeWate体积不应小于30 μl，体积过小影响回收率。
2）如果要提高RNA的产量，可用30-50 μl新的RNase-FreeWater重复步骤13。
3）如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤13。
