保存条件：-20℃保存，有效期一年。产品介绍：

 

pBM16A Toposmart克隆试剂盒利用痘苗病毒的拓扑异构酶I(Topoisomerase I)的切割再连接的特点将片段克隆到载体中。不仅适用于克隆由Pfu、KOD、Xerox、Phusion 和Q5等高保真DNA聚合酶扩增的平末端PCR产物，也可克隆由Taq、Tth和klenTaq等DNA聚合酶扩增的带A尾的PCR产物。试剂盒中的pBM16A载体为线性化的质粒。可以用引物对M13F和M13R进行菌落PCR鉴定阳性克隆。

 

产品特点：

 

（1）连接反应仅需5 分钟。

 

（2）适用于平末端PCR产物和带A尾的PCR产物。

 

（3）载体采用了新的制备工艺，无需蓝白斑筛选。

 

（4）克隆位点两旁都有Smal和EcoR V酶切位点，适合单酶切鉴定。

 

（5）载体具有氨苄青霉素抗性。

 

操作步骤：

 

1.连接反应

 

按下表，在一个0.2ml PCR 管中依次加入

 

成分	体积
DNA *#片段	0.5-8µl
pBM16A Topo载体	1ml
10×Toposmart	1ml
补水至总体积	10ml

 

 

加完试剂后，轻轻混匀低速离心，使溶液集中在管底。

 

注意：此步骤不要在低温条件下（冰水浴）上操作。

 

2.反应温度及片段要求

 

室温下（20-30℃）放置 0-5 分钟，然后将离心管放置在冰上。如当天不进行转化实验。请将连接产物置于-20℃保存。

 

注意：DNA *#片段的用量见下表

 

 

 

室温下（20-30℃）反应时间 5-30 分钟，如果室温较低，推荐使用 PCR 仪器控制温度。可以设置 25℃反应 5 分钟。如果 PCR 产物电泳检测仅有很锐利明亮的条带，无引物二聚体和非特异性条带存在，可直接取 0.5-1µl PCR 产物原液进行克隆。

 

3.阳性对照反应

 

取1µl 试剂盒提供的1kb长度的对照片段LacZ 基因α肽片段进行克隆，转化具有α 互补功能的大肠杆菌感受态细胞（如 DH5α,*0,Mach1-T1 等）。菌液涂布在含有IPTG,X-gal 的LB 氨苄平板上，次日蓝色菌落为阳性克隆，说明有片段插入，白色菌落为空载体。

 

4.转化

 

1.取5µl 连接产物到50-100µl 刚刚融化的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴2-30 分钟。

 

2.42℃水浴中热击30 秒钟。

 

3.立刻置于冰水浴中2 分钟。

 

加入300-500µl 无菌的不含抗生素的SOC 或LB，37℃，200-250rpm 振荡培养60 分钟。

 

注：小于 2kb 片段可以不复苏，直接涂平板。

 

4.吸取200µl 菌液涂布。为了得到更多的菌落，可以先4000rpm 离心1 分钟，去掉部分上清，用移液器轻吹菌体，充分悬浮菌液，取全部菌液涂布，然后 37℃培养过夜（12-16 小时）。

 

5.阳性重组子的鉴定菌落 PCR

 

（1）菌落PCR方法鉴定阳性克隆

 

① 用10l吸头挑选克隆至预先加有10μl无菌水或LB培养基的PCR管中，吹打混合。

 

② 25l PCR反应体系：取2μl细菌悬液为模板、加入5μM 浓度的M13F/M13R各

 

1μl进行PCR扩增。

 

③PCR扩增条件：95℃预变性5分钟（裂解细胞，失活核酸酶），94℃变性10秒钟，55℃退火10秒钟，72℃延伸（ 根据片段的大小决定延伸时间，通常每1min/1kb）X秒，30个循环，72℃后延伸5分钟。1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，有强烈的明显条带的克隆为重组体，与插入片段大小相近（M13F/M13R 引物在克隆位置的两侧，所以PCR扩增出的DNA的长度比插入片段大138bp） 可视为阳性克隆。菌落PCR方法鉴定重组子时一定要设立一个不加菌液的阴性对照。

 

（2）测序：用M13F、M13R通用引物对阳性质粒进行测序分析。

 

pBM16A载体图谱

 

常见问题分析

 

重组子克隆菌少，或阳性率低：

 

(1)感受态效率低，使用转化效率>5×107cfu/µg 的感受态细胞

 

(2)连接反应在低温下（如放碎冰上）操作，应该在室温下操作。

 

(3)PCR 片段加入量太多或太少，按照推荐量加入。

 

(4)PCR 纯度低，重新扩增或重新纯化PCR 产物。

 

(5)PCR 质量低，切胶时在紫外下照射时间长，需重新制备。

 

(6)PCR 扩增结束后，应该再延伸 5-10 分钟，确保片段延伸*。

 

(7)转化后没有复苏培养，可以加入 SOC 或LB，培养 60 分钟。

 

(8)克隆基因可能对宿主菌有毒性，比如某些编码膜蛋白和 DNA 结合蛋白的基因， 某些启动子和调节序列基因，或含有倒置或串联重复序列的基因，选用室温过夜培养平板。

 

载体序列：

 

>pBM16A Topo AGTGAGTTGATTGTGTAAAACGACGGCCAGTGTCTGAGGCTCGCTTCAGTCCTGATGCTTGATATCCCGGGCGT GTCGCCCTT$$$$AAGGGCGACACGCCCGGGATATCGCGTCTGCCTGAAGTCAATACTGACGATGGTCATAGCT GTTTCCTGTCCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCC AACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGA AGCTAAAATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCACTTATTCCGTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTG CTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTG GATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGT TCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTC AGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGC AGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCT AACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCA TACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAA CTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCG CTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGCTCTCGCGGTATCATTG CAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGAT GAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAATGAGGGCCCAAATGTAATCA CCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATC ACAAAAATCGATGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGA AGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAG CGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTG TGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGA CACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGA GTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAG TTACCTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTT GCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATTTTCTACCGAAGAAAGGCCCAC CCGTGAAGGTGAGCC

 

本产品仅供研究不用于临床诊断