血液RNA提取试剂盒（）说明书

RNApure Blood Kit（DNase I）

血液RNA提取试剂盒（DNase I）

Cat. No.   K0538

保存：DNase I、10×Reaction Buffer：-20℃

其它组分：室  温

组分说明

          Cat. No.                          K0538

          Kit Size                           50

          DNase I                          1000 U

          10×Reaction Buffer        1000  μl

          Buffer RBL（10×）       60 ml

          Buffer RL                             35 ml

          Buffer RW1                            40 ml

          Buffer RW2（concentrate）   11 ml

          RNase-Free Water                     10 ml

          Shredder Spin Column                50

          Spin Column RM                   50

          Collection Tube（1.5 ml）     50

          Collection Tube（2 ml）      100

产品简介

    本试剂盒适用于从新鲜全血（用柠檬酸盐、EDTA 或肝素等抗凝剂处理过的血液样品）中提取总  RNA，可以处理多至1.5  ml 的全血，洗脱得到分子量大于 200 bp 的高纯度 RNA，多个样品可以在 1 小时内同时完成。本产品无需 CsCl 纯化的超离心步骤和 LiCl 或乙醇沉淀，不含有苯酚或氯仿等有毒溶剂，经过纯化的 RNA 有效去除血红素、肝素等酶抑制剂和污染物，可直接用于各种分子生物学常规实验，如 RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、体外翻译等实验。

注意事项

1.  预防 RNase 污染，应注意以下几方面：

    1）使用无 RNase 的塑料制品和枪头，避免交叉污染。

    2）玻璃器皿应在使用前于 180℃高温下干烤 4 小时，塑料器皿可在 0.5M NaOH 中浸泡 10 分钟，用水*冲洗后高压灭菌。

    3）配制溶液应使用无 RNase 的水。

    4）操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。

2.  样品应避免反复冻融，否则影响提取 RNA 提取得率和质量。样品在 Buffer RL 中，可于-70℃保存一个月。

3.  Buffer RL 在使用前请加入β-巯基乙醇，1 ml Buffer RL 加 10  μl  β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的 Buffer RL 室温可保存 1 个月。

4.  第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在 Buffer RW2 中加入无水乙醇。

5.  使用前请检查 Buffer RL 是否出现结晶或者沉淀，可置于于 56℃水浴重新溶解。

6.  本试剂盒不能用于加入抗凝剂的冷冻血液样本 RNA  的提取。  

7.  10×Buffer RBL 需在使用前将溶液用无 RNase 的水进行 10 倍稀释，稀释后置于 2-8℃保存。

自备试剂： β-巯基乙醇、无水乙醇

操作步骤

1.  向0.5-1.5 ml  新鲜的抗凝全血样本中，加入5倍体积的1x Buffer RBL（请于使用前用无RNase水将10×Buffer RBL稀释10倍），轻轻涡旋或颠倒混匀。冰上孵育10-15分钟，孵育过程中混匀两次。

    注意：孵育过程中浑浊的悬液会变成透明，证明红细胞被裂解，必要时可以把孵育时间延长至20分钟。

2.  4℃  2,100 rpm（~400×g）离心10分钟，小心吸弃上清。

3.  向以上沉淀中加入2倍血液样本体积的1×Buffer  RBL（请于使用前用无RNase水将10×Buffer RBL稀释10倍），轻轻涡旋，充分重悬沉淀。

4.  4℃  2,100 rpm离心10分钟，小心并*吸弃上清。

    注意：此步一定要*去除上清否则影响裂解导致RNA产量下降。

5.  向沉淀中加入Buffer RL（使用前检查是否已经加入β-巯基乙醇），0.5-1.5 ml血液样本加入600  μl Buffer RL，或小于0.5 ml  血液样本加入350 μl Buffer RL，混匀。

6.将所得液体转移到已装入收集管（Collection Tube）的过滤柱（Shredder Spin Column）中，12,000 rpm（~13,400×g）离心2分钟，收集滤液，弃掉过滤柱。

7. 向所得滤液中加入1倍体积（600  μl或350 μl）的70%乙醇（无RNase水配制），混匀。

    注意：加入乙醇后可能会产生沉淀，不会影响后续实验。

8.将上步所得溶液全部加入到已装入吸附柱（Spin Column RM）中（已装入收集管），若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000 rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

9.  向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1，10,000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

10.  配制DNase I  混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8  μl 10×Reaction Buffer 和20  μl DNase I（1U/μl），混匀，  配制成终体积为80 μl的反应液。

11.  向吸附柱中直接加入80 ?l DNase I  混合液，20-30℃孵育15分钟。

12.  向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1，10,000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

13.  向吸附柱中加入500  μl Buffer RW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

14.  重复步骤13。

15.  12,000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以*晾干。

    注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR  等）。

16.  将吸附柱置于一个新的RNase-Free的1.5  ml  离心管（自备）中，向吸附柱的中间部位加入  30-50 μl  RNase-Free Water，室温放置1分钟，12,000 rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

注意：1）RNase-Free Wate体积不应小于30  μl，体积过小影响回收率。

2）如果要提高RNA的产量，可用30-50  μl新的RNase-Free Water重复步骤16。

3）如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤16。

实验代做服务：