酵母RNA提取试剂盒( DNase I )说明书
RNApure Yeast Kit ( DNase I )
Cat. No. K0629
保存:Lyticase、DNase I、10×Reaction Buffer:-20℃
其它组分:室温
组分说明
Catalog no. K0629
Kit Size 50
DNase I 1000 U
10×Reaction Buffer 1000 μl
Buffer RL 35 ml
Buffer RW1 40 ml
Buffer RW2(concentrate) 11 ml
RNase-Free Water 10 ml
Lyticase Working Buffer 30 ml
Lyticase 300 μl
Spin Column RM 50
Collection Tube(1.5 ml) 50
Collection Tube(2 ml) 50
产品简介
本试剂盒用于常见的各种真菌的总 RNA 的快速提取。既可以提取液体培养物,也可以直接提取固体培养基上的真菌菌落。操作简单快捷,单个样本 30 分钟内可以完成提取全过程,所提 RNA 纯度高,OD260/280一般都在 2.0 左右。提取的 RNA
适用于 RT-PCR、Real-time RT-PCR、Northern Blot 、cDNA 合成等实验。
注意事项
1. 预防RNase污染,应注意以下几方面:
1) 使用无RNase的塑料制品和枪头,避免交叉污染。
2) 玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时,塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟,用水*冲洗后高压灭菌。
3) 配制溶液应使用无RNase的水。
4) 操作人员戴一次性口罩和手套,实验过程中要勤换手套。
2. 样品应避免反复冻融,否则会影响RNA提取的的量和质量。对于有些细胞壁较厚以及在培养阶段会产生大量代谢物的酵母,最好在生长的早期就收集样品。
3. 使用前请检查Buffer RL是否出现结晶或者沉淀,可置于56℃水浴重新溶解。Buffer RL在使用前请加入β-巯基乙醇,至终浓度为1%。如1 ml Buffer RL加10 μl β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的Buffer RL室温可保存1个月。
4. Lyticase Working Buffer在使用之前应加入β-巯基乙醇,1 ml的Lyticase Working Buffer加入10 μl的β-巯基乙醇,加入β-巯基乙醇的Lyticase Working Buffer可以在室温下储存1个月。
5. 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在Buffer RW2中加入无水乙醇。
自备试剂:β-巯基乙醇、无水乙醇(新开封或提取RNA专用)、70%乙醇(用无RNase的水配制)
操作步骤
1. 取约1-5 ml 酵母培养物,12,000 rpm(~13,400×g)离心1分钟,尽量吸取全部上清(菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
注意:酵母培养物最多不超过3×107个细胞,一般对于酿酒酵母OD600值为1.0时,相当于1-2×107细胞/ml。
2. 酵母细胞壁的去除:向菌体中加入600 μl Lyticase Working Buffer(使用前检查是否加入β-巯基乙醇,使其终浓度为1%),并加入5μl Lyticase(10 U/μl),充分混匀,并在摇床上220 rpm/min,30℃处理30分钟。4,000 rpm(~1,500×g)离心10分钟,弃上清,收集沉淀。
注意:以上为3×107 个酵母细胞Lyticase用量,根据酵母的菌株和酵母细胞数量的不同,所用的Lyticase的浓度和孵育时间应该进行适当调整。
3. 向沉淀中加入350 μl Buffer RL(使用前加入终浓度为1%的β-巯基乙醇)反复吹打几次,使其充分裂解。如果有可见不溶物,最大转速离心2分钟,取上清进行下一步。
注意:尽量使细胞充分悬浮并充分裂解否则影响RNA产量。
4. 向步骤3所得到的溶液中加入1倍体积(350 μl)的70%乙醇(RNase-Free Water配制),混匀。
5. 将步骤 4 所得溶液全部加入到已装入收集管(Collection Tube 2ml)的吸附柱(Spin Column RM)中,若一次不能加完溶液,可分多次转入。12,000 rpm 离心 15 秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
注意:若一次不能将全部溶液加入吸附柱中,请分两次转入。
6. 向吸附柱中加入 350 μl Buffer RW1,10,000 rpm 离心 1 分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
7. 配制 DNase I 混合液:取 52 μl RNase-Free Water,向其中加入 8 μl 10 × Reation Buffer 和 20 μl DNase I(1U/μl),混匀, 配制成终体积为 80 μl 的反应液。
8. 向吸附柱中直接加入 80 µl DNase I 混合液,20-30℃孵育 15 分钟。
9. 向吸附柱中加入 350 μl Buffer RW1, 12,000 rpm 离心 15 秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
10. 向吸附柱中加入 500 μl Buffer RW2(使用前检查是否加入无水乙醇),12,000 rpm 离心 15 秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
11. 重复步骤 10。
12. 12,000 rpm 离心 2 分钟,倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟,以*晾干。
注意:这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除,乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR 等)。
13. 将吸附柱置于一个新的无 RNase 离心管(Collection Tube 1.5 ml),向吸附柱的中间部位悬空加入 30-50 μl RNase-Free Water,室温放置 1 分钟,12,000 rpm 离心 1 分钟,收集 RNA 溶液,-70℃保存。
注意:1)RNase-Free Water 体积不应小于 30 μl,体积过小影响回收率。
2)如果要提高 RNA 的产量,可用 30-50 μl 新的 RNase-Free Water 重复步骤 10。
3)如果要提高 RNA 浓度,可将得到的溶液重新加入到吸附柱中,重复步骤 10。
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