克伦特罗快速检测试剂盒说明书

一、原理

本试剂盒采用间接竞争 ELISA 方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物克伦特罗将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗克伦特罗抗体，加入酶标记物后，用 TMB 底物显色，样本吸光值与其所含残留物克伦特罗的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物克伦特罗的含量。

二、试剂盒特性

试剂盒灵敏度：  0.1ppb

孵育温度： 25℃

孵育时间： 30min～15min

样本检测下限

尿 样                                 0.1ppb

组 织（处理法一）                    0.4ppb

组 织（处理法二）                     0.1ppb

饲 料                                 1ppb

交叉反应率

克伦特罗（Clenbuterol）                100%

特pu他林（Terbutalin）                  <1%

马布特罗(Mabuterol)                    <1%

溴布特罗(Brombuterol)                  <1%

沙丁胺醇（Salbutamol ）               <1%

莱克多巴胺（Ractopamine）            <1%

样本回收率

尿 样                 95%±22%

组 织                 75%±20%

饲 料                 80%±20%

三、试剂盒组成  

  1 微量测试孔 每条 8 孔，一板 12 条

     标准液×6 瓶 0ppb 0.1ppb

2  0.3ppb 0.9ppb

 （1ml/瓶）  

  2.7ppb 8.1ppb

3 酶标记物 7ml 红色帽

4 抗体工作液 10ml 蓝色帽

5 底物 A 液 7ml 白色帽

6 底物 B 液 7ml 黑色帽

7 终止液 7ml 黄色帽

四、所用仪器、试剂

具备的仪器：酶标仪、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮吹仪、恒温箱、打印机

微量移液器：单道 20～200µl、单道 100～1000µl、多道 30～300 µl

试 剂：乙酸乙酯、乙腈、氢氧化钠、浓盐酸、

甲醇、无水硫酸钠、正己烷

五、样本前处理步骤

样本处理前须知

（a）实验中必须使用一次性吸头，吸取不同试剂时要更换吸头。

（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

u 样本前处理需配制：

配液 1  0.1M HCl 溶液取 0.86ml 浓 HCl 加水定溶至 100ml。

配液 2  0.1M NaOH 溶液称取 0.4g NaOH 加水定溶至 100ml。

配液 3  乙腈-0.1M HCl 溶液V 乙腈：VHCl =84：16。

样本处理：

（a）尿样本的处理方法

取 20µl 清亮尿样直接测定（如果尿样浑浊一定要过滤或 4000r/min 离心 10min，直至得到清亮尿样），暂不使用的样本应冷冻保存。 3、 在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于样本稀释倍数:  1 倍 洗板的一致性，正确的洗板操作是 ELISA 测定

（b）组织样本的处理方法一 程序中的要点。

1、称 2±0.05g 均质后的组织至 50ml 离心管中，加 4、 所有恒温孵育过程，避免光线照射，用盖板膜入 6ml 去离子水，充分振荡 2min，室温 盖住微孔板。

4000r/min 以上离心 10min(注：若组织样本中油 u  操作步骤：

脂含量较高，可在振荡后放入 85℃水浴 10min 1、从 2～8℃冷藏环境中取出所需试剂，室温（20～后再离心)； 25℃）平衡 30min 以上，注意每种液体试剂使

2、取 20µl 上层液进行分析。 用前均须摇匀。

样本稀释倍数:  4 倍 2、取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放

（c）组织样本的处理方法二 入自封袋，保存于 2～8℃。

1、称取 2 ± 0.05g 均质后的组织于 50ml 离心管 3、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每中，加入 6ml 乙腈-0.1MHCl，振荡 2min,室温 个样本和标准品做 2 孔平行，并记录标准孔和

4000r/min 以上离心 10min； 样本孔所在的位置。

2、取上清 3ml，加入 2ml 0.1M NaOH，加入 6ml 4、加标准品/样本 20µl/孔到各自的微孔中，然后加乙酸乙酯，振荡 1min，室温 4000r/min 以上离 酶标记物 50µl/孔，再加入 80µl/孔的抗体工作心 10min。取全部上清于 50～60℃氮气流或空 液，用盖板膜盖板，轻轻振荡混匀，25℃环境气流吹干； 反应 30min。

3、加入 1ml 去离子水溶解干燥后的残留物，混合 5、将孔内液体甩干，用去离子水 250µl/孔洗板 4～30s； 5 次，每次间隔 15～30 秒，用吸水纸拍干（拍

4、取 20 µl 用于分析。 干后未清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

样本稀释倍数： 1 倍 6、显色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B

（d）饲料处理方法 液 50µl/孔，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显

1、称1.0±0.05g 研碎的饲料样品于50ml 离心管中， 色 15min。

加入 10ml 甲醇，再加入 5g 无水硫酸钠，充分 7、测定：加入终止液 50µl/孔，轻轻振荡混匀，设振荡 2min；15℃ 4000r/min 以上离心 10min； 定酶标仪于 450nm 处（建议用双波长 450/630n

2、吸出离心后的上清液 1ml，于 50～60℃氮气流 m 检测，5min 内读数），测定每孔 OD 值。或空气流吹干，用 1 ml 去离子水溶解干燥后的 七、结果判定残留物，再加入 1ml 正己烷混合 30s ；15℃ 结果判定有两种方法，粗略判定可用第 1 种方4000r/min 以上离心 5min；去除上层有机相；

 法，定量判定用第 2 种方法。注意样本吸光度值与

3、取下层 20 µl 用于分析。

 其所含克伦特罗量成负相关。

 样本稀释倍数：10 1、粗略判定：

 六、酶标免疫分析程序: 用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出

u   测定前应须知： 其浓度范围(ng/ml)。假设样本 1 的吸光度值为 0.3，

1、 使用前将需用试剂和板条的温度回升至室温 样本 2 的吸光度值为 1.0，标准液吸光度值分别是：（20～25℃）。 0ppb 为 2.243； 0.1ppb 为 1.816；0.3ppb 为 1.415；

2、 使用之后立即将所有试剂放回 2～8℃。 0.9ppb 为 0.74；2.7ppb 为 0.313；8.1ppb 为 0.155。则样本 1 的浓度范围是 2.7ppb～8.1ppb；样本 2 的浓度范围是 0.3ppb～0.9ppb，乘以其对应的稀释倍数即为样本中克伦特罗实际浓度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0 标准）的吸光度值，再乘以 100%，即B百分吸光率（%）＝ ×100%B0

（2）B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml 标准溶液的平均吸光度值

（2）标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以克伦特罗标

准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中克伦特罗实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。

八、注意事项:

1、室温低于 25℃或试剂及标本未回到室温（20～25℃）会导致所有标准的 OD 值偏低。

2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、反应终止液为 2M 硫酸，避免接触皮肤。

5、不要使用过了有效日期的试剂盒；稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD 值变化；不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。标准品 1 的吸光度值小于 0.5 时，表示试剂可能变质。

8、该试剂盒最jia反应温度为 25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

九、储藏条件和保质期

1、储藏条件：试剂盒于 2-8℃保存，不要冷冻。

2、保 质 期：该产品有效期为 1 年，生产日期见包装盒。

提示：酶标板真空包装袋若有漏气，酶标板仍然正常有效，不影响实验结果，请放心使用。

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