EF44A\J2
苯乙醇胺A
快速检测试剂盒说明书
一、原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物苯乙醇胺A将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗苯乙醇胺A抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物苯乙醇胺A的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物苯乙醇胺A的含量。
二、试剂盒特性
u 试剂盒灵敏度： 0.1ppb
u 孵育温度： 25℃
u 孵育时间： 30min～15min
u 样本检测下限
尿 样 ····························· 0.1ppb
组 织 ····························· 0.2ppb
饲 料 ····························· 0.5ppb
u 交叉反应率
苯乙醇胺A ······································ 100%
克伦特罗（Clenbuterol） ························ <1%
沙丁胺醇（Salbutamol ） ····················· <1%
莱克多巴胺（Ractopamine）··················· <1%
u 样本回收率
尿 样 ······························ 95%±25%
组织、饲料 ······························ 85%±25%
三、试剂盒组成
1 | 微量测试孔 | 每条8孔，一板12条 | |
2 | 标准液×6瓶 （1ml/瓶） | 0ppb | 0.1ppb |
0.3ppb | 0.9ppb | ||
2.7ppb | 8.1ppb | ||
3 | 酶标记物 | 7ml | 红色帽 |
4 | 抗体工作液 | 10ml | 蓝色帽 |
5 | 底物A液 | 7ml | 白色帽 |
6 | 底物B液 | 7ml | 黑色帽 |
7 | 终止液 | 7ml | 黄色帽 |
8 | 20X浓缩洗涤液 | 40ml | 白色帽 |
9 | 2X浓缩复溶液 | 50ml | 透明帽 |
四、所用仪器、试剂
具备的仪器：酶标仪、打印机
微量移液器：单道 20～200µl、单道100～1000µl、多道 30～300 µl
使用的试剂：乙酸乙酯、冰乙酸、正己烷
五、样本前处理步骤
u 样本处理前须知
（a）实验中必须使用一次性吸头，吸取不同试剂时要更换吸头。
（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。
u 样本前处理需配置
配液1 样本提取液：
取99ml乙酸乙酯，加入1ml冰乙酸，混合均匀。
配液2 样本复溶液：
将2X浓缩复溶液用去离子水按1：2稀释。
u 样本处理：
（a）尿样本处理方法
取20µl清亮尿样直接测定（如果尿样浑浊一定要过滤或4000r/min离心10min，直至得到清亮尿样），暂不使用的样本应冷冻保存。
样本稀释倍数: 1倍
因样本存在一定干扰，建议以1ppb为样本阳性 的CUT OFF值。
（b）组织样本处理方法
1、 称取均质后的组织样本2±0.05g到50ml离心管中；
2、 加入8ml样本提取液，涡旋震荡2min；
3、 室温4000r/min离心10min；
4、 取上层清液2ml于50-60℃吹干；
5、 加入1ml正己烷，再加入1ml样本复溶液，涡旋震荡30秒；
6、 室温4000r/min离心10min；除去上层有机相；
7、 取下层清液20µl用于分析。
样本稀释倍数: 2倍
因样本存在一定干扰，建议以1ppb为样本阳性的CUT OFF值。
（c）饲料样本处理方法
1、 称取均质后的饲料样本1±0.05g到50ml离心管中；
2、 加入10ml样本提取液，涡旋震荡3min；
3、 室温4000r/min离心10min；
4、 取上层清液2ml于50-60℃吹干；
5、 加入1ml正己烷，再加入1ml样本复溶液，涡旋震荡30秒；
6、 室温4000r/min离心10min；除去上层有机相；
7、 取下层清液20µl用于分析。
样本稀释倍数: 5倍
因样本存在一定干扰，建议以2ppb为样本阳性的CUT OFF值。本试剂盒检测牛尿时回收率偏高。
六、 酶标免疫分析程序:
u 测定前应须知：
1、 使用前将需用试剂和板条的温度回升至室温（20～25℃）。
2、 使用之后立即将所有试剂放回2～8℃。
3、 在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
4、 所有恒温孵育过程，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。
u 操作步骤：
1、 从2～8℃冷藏环境中取出所需试剂，室温（20～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、 配液：将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。
3、 取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2～8℃。
4、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5、 加标准品/样本20µl/孔到各自的微孔中，然后加酶标记物50µl/孔，再加入80µl/孔的抗体工作液，用盖板膜盖板，轻轻振荡混匀，25℃环境反应30min。
6、 将孔内液体甩干，用稀释好的洗涤液250µl/孔洗板4～5次，每次间隔15～30秒，用吸水纸拍干（拍干后未清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
7、 显色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。
8、 测定：加入终止液50µl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，5min内读数），测定每孔OD值。
七、结果判定
结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光度值与其所含苯乙醇胺A量成负相关。
1、粗略判定：
用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样本1的吸光度值为0.3，样本2的吸光度值为1.0，标准液吸光度值分别是：0ppb为2.143； 0.1ppb为1.866；0.3ppb为1.615；0.9ppb为0.964；2.7ppb为0.413；8.1ppb为0.155。则样本1的浓度范围是0.3ppb～0.9ppb；样本2的浓度范围是2.7ppb～8.1ppb，乘以其对应的稀释倍数即为样本中苯乙醇胺A实际浓度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光率（%）＝ | B | ×100% |
B0 |
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值
（2）标准曲线的绘制与计算
以标准品百分吸光率为纵坐标，以苯乙醇胺A标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中苯乙醇胺A实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）
八、 注意事项
1、 室温低于25℃或试剂及标本未回到室温（20～25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。
4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5、 不要使用过了有效日期的试剂盒；稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值变化；不要交换使用不同批号的盒中试剂。
6、 不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。标准品1的吸光度值小于0.5时，表示试剂可能变质。
8、 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
九、储藏条件和保质期
1、 储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，不要冷冻。
2、 保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。
提示：酶标板真空包装袋若有漏气，酶标板仍然正常有效，不影响实验结果，请放心使用。
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