一、实验原理
　　
　　本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中AIF水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入AIF抗原、生物素化的抗小鼠AIF抗体、HRP标记的亲和素，经过*洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的AIF呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
　　
　　二、试剂盒组成及试剂配制
　　

试剂盒组成	96孔配置	标本的采集及保存 每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为20,000 pg/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释10,000 pg/ml，5,000 pg/ml，2,500 pg/ml，1,250 pg/ml，625 pg/ml，312 pg/ml，156 pg/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/ml，临用前15分钟内配制。如配制10,000 pg/ml标准品：取0.5ml 20,000 pg/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 6. 检测溶液A：1×120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。7. 检测溶液B：1×120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
浓洗涤液	1×30ml/瓶
酶联板（Assay plate ）	一块（96孔）
标准品（Standard）	2瓶（冻干品）
样品稀释液（Sample Diluent）	1×20ml/瓶
检测稀释液B	1×10ml
检测稀释液A	1×10ml
覆膜	5张
底物溶液（TMB Substrate）	1×10ml/瓶
终止液（Stop Solution）	1×10ml/瓶（2N H2SO4）
说明书	1份

　　
　　三、标本的采集及保存
　　
　　1.细胞培养物上清：请离心后收集上清，并将标本保存于-20℃，且应避免反复冻融。
　　
　　2.血清：标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
　　
　　3.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°C1000xg离心15分钟，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
　　
　　注：标本溶血会影响zui后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
　　
　　四、操作步骤
　　
　　实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。
　　
　　1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。
　　
　　为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
　　
　　2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100ul（取1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。
　　
　　3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。
　　
　　4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100ul，37℃，60分钟。
　　
　　5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。
　　
　　6.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。
　　
　　7.依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
　　
　　8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15分钟以内进行检测。
　　
　　注：
　　
　　1.为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上覆膜或盖。
　　
　　2.未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液
　　
　　3.每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
　　
　　4.建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
　　
　　五、洗板方法
　　
　　手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。
　　
　　六、自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
　　
　　七、特异性
　　
　　本试剂盒可同时检测重组或天然的小鼠AIF，且与其它相关蛋白无交叉反应。
　　
　　八、预期应用
　　
　　ELISA法定量测定小鼠血清、血浆或其它相关液体中凋亡诱导因子（AIF）含量。
　　
　　九、概述
　　
　　凋亡诱导因子（apoptosis-inducingfactor,AIF）是位于线粒体膜间隙的一种黄素蛋白。在凋亡信号刺激时，AIF分子从线粒体释放到细胞浆，然后转位到细胞核内，引起染色体核周边凝集和DNA呈大片段断裂，从而使细胞发生凋亡的特征性改变。AIF所诱导的细胞凋亡是独立于caspases系统的另一条更原始和更保守的凋亡途径，因而不受caspases抑制剂的抑制。凋亡与许多眼病的发生具有密切的关系。
　　
　　十、计算
　　
　　以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
　　
　　十一、注意事项
　　
　　1.洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
　　
　　2.一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
　　
　　3.请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。
　　
　　4.如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请zui后乘以稀释倍数。
　　
　　5.在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。
　　
　　6.底物请避光保存。
　　
　　十二、说明
　　
　　1.在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。
　　
　　2.小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本/标准品，酶结合物或底物时，*个孔与zui后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。而且，洗涤不充分将影响试验结果。
　　
　　3.试剂盒保存：部分试剂保存于-20℃，部分试剂保存于2-8℃，具体以标签上的标示为准。
　　
　　4.浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
　　
　　5.刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
　　
　　6.中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
　　
　　7.所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。
　　
　　十三、有效期：6个月
　　
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