可乐定检测试剂盒使用说明书

【原理】

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物可乐定与微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗磺胺的抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含可乐定的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出残留物可乐定的含量。

【试剂盒技术指标】   

规      格：96孔/盒

灵 敏 度：0.2ppb

检测时间： 45min

样本检测下限：

尿     样  …………………………………   0.2ppb

组    织   …………………………………  0.4ppb

饲    料  …… ……………………………   8ppb

交叉反应率：

可乐定…………………   100%

样本回收率：

尿     样   ……………………… 95%±10%

组     织   ……………………… 85%±15%

饲     料   ……………………… 85%±15%

【试剂盒组成】

2、 微量测试孔：1×96孔板（12条×8孔）

3、 （标准溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.2ppb、0.6ppb、1.8ppb、5.4ppb、16.2ppb

4、 可乐定高浓度标准溶液（1ml/瓶）100 ppb

5、 酶标记物 7ml…………………………红色帽

6、 抗体工作液  7ml……………………… 绿色帽

7、 底物A液     7ml  ……………………棕色帽

8、 底物B液     7ml  ……………………黑色帽

9、 终  止  液     7ml  ……………………黄色帽

10、 2X浓缩复溶液50 ml  ………………蓝色帽

11、 2X浓缩洗涤液40 ml  ………………白色帽

【 所用仪器、试剂】

具备的仪器：微孔酶标仪、氮气吹干装置、打印机、均质器 、振荡器、离心机、恒温箱、天平（感量0.01g）、刻度移液管

微量移液器：单道20µl-200µl、100µl-1000µl、多道 250µl

试            剂： 浓HCl、甲醇、

【实验前溶液配制】

配液1、将2X浓缩复溶液用去离子水按照1：1稀释（1 份浓缩复溶液+1份去离子水）用于样本的复溶。

配液2、将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照 1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。

配液3、 0.1M HCl 溶液

取0.86ml浓HCl加水定溶至100ml。

配液4、样品提取液溶液

               取1ml  0.1M盐酸加到99ml甲醇中。

【样本前处理步骤】

样本处理前须知

处理任何样本时，都必须注意：

（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

（c）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

（a）尿样本的处理方法（样本稀释倍数：1）

取50µl清亮尿样直接测定（如果尿样浑浊一定要过滤或离心10min，4000r/min，直至得到清亮尿样），暂不使用的样本应冷冻保存。

由于尿液阴性样本可能会产生背景干扰 （在某些情况下干扰数值在标准2到3之间），所以推荐标准3即0.3ppb作为尿液阳性结果的CUT OFF判断值。

（b）组织样本的处理方法（样本稀释倍数：2）

1． 称取2 ±0.05g的组织，加入4ml样品提取液，振荡2min,室温4000r/min以上离心10min。

2． 取上清2ml，于50℃氮气或空气吹干。

3． 加1 ml正己烷溶解干燥的残留物，再加1ml稀释后的复溶液强烈振荡混合30s，室温4000r/min以上离心5min。

4． 取50µl进行分析。

（C）饲料样品的处理方法（样本稀释倍数：40）

1. 称1.0±0.05g研碎的饲料样品，加入4ml样品提取液，放振荡器上振荡2min；室温 4000r/min以上离心10min；

2. 取出上清液50ul与450ul稀释好的复溶液混合30s。

取50ul上清进行分析。

【酶标免疫分析程序】   

操作步骤：

1、 将所需试剂从冷藏环境中取出，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、 按板架及需要取出微孔条，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

4、 加标准品/样本50µl /孔，然后加酶标记物50μl/孔，再加入抗体工作液50µl/孔。轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，25℃环境反应30min。

5、 取出用洗涤液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）

6、 显色：每孔加入底物液A液50µl再加B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境避光显色15min。

7、 测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测在5min内读完数据），测定吸光度值（OD值）。

【结果判定】   

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与可乐定的含量成负相关。

1、 粗略判定

用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng /ml)。假设样本1的吸光度值为0.221，样本2的吸光度值为0.795，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.81；0.2ppb为1.50；0.6ppb为1.114；1.8ppb为0.660； 5.4ppb为0.318；16.2ppb为0.145。则样本1的浓度范围是5.4ppb-16.2ppb；样本2的浓度范围是0.6ppb-1.8ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中可乐定实际含量。

2、 定量分析

（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即：

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

（2）标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以可乐定浓度（ng /ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中可乐定实际含量。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）

3、标准曲线：

B/B0 (%)

         0.2                0.6                1.8                   5.4               16.2

 (ppb) [µg/kg]

图1：可乐定检测试剂盒的回归曲线

4、再现性：

%CV 

      0      0.2            0.6             1.8          5.4         16.2

(ppb) [µg/kg]

图2：可乐定检测试剂盒的精密度

由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出可乐定检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应可乐定浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

【注意事项】   

1、 使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A_450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8、 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】

原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。

【有效期】

有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。

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