羊痘病毒(GaPV)核酸检测试剂（荧光PCR法，外源内标）
包装规格：48 T/盒
产品说明：
采用Taqman探针技术，以羊痘病毒(GaPV，羊痘病毒属包含绵羊痘病毒、山羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒等3种病毒)的特异性保守基因为靶位点设计特异性引物和探针，用于样品中GaPV核酸的辅助检测。本产品引入了dUTP / UDG 系统，可降解含U的ssDNA和dsDNA，消除由PCR产物导致的交叉污染。 同时设置阳性内对照 (即内标，使用VIC报告基团)，通过检测内标是否正常来监测qPCR体系中是否含有 PCR抑制物，避免出现假阴性结果。
产品组成：
组分名称 | 主要成分 | DV231Y-21-V1 | |
1 | GaPV PreMix-2 | qPCR反应缓冲液、dNTPs、UDG酶、Taq酶、引物、探针等 | 960 μL/管 |
2 | GaPV阴性对照-2 | 无酶水 | 400 μL/管 |
3 | GaPV内标对照-2 | 含内标扩增片段的核酸 | 480 μL/管 |
4 | GaPV阳性对照-2 | 含目标扩增片段的核酸 | 50 μL/管 |
注：不同批号产品的成分之间不可以混用或互换！！！
储存条件和保质期：
在-20±5℃避光储存，有效期12月。干冰运输。重复冻融小于5次。生产日期，失效日期请见外包装盒。
适用仪器：
ABI7500、宏石96P、Bio-Rad CFX96实时荧光PCR仪等。
样品要求：
1、适用样品类型
活体或剖检牛羊的皮肤丘疹、肺部病变组织、淋巴结、血液等样品。
要求送检新鲜样品，禁止反复冻融！
2、样品处理（核酸提取区）
参照《NY/T 541-2016 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范》等标准进行样品前处理， 使用商业化的提取试剂盒提取样品中的核酸。提取时，每200 μL阴性对照和处理后的样品溶液中添加10 μL内标对照，提取后的核酸应立即检测，否则冻存于-20±5℃，保存时间不超过6个月，禁止反复冻融！
*内标对照的其它使用方法：将内标对照混入 qPCR工作液中，但仅仅质控扩增过程和监测qPCR体系中是否含有 PCR抑制物，不能质控提取核酸过程。
检测方法
为了防止污染，实验需分区操作！！！
注：核酸提取参照样品要求，在核酸提取区进行或在样品处理区进行。
1、试剂准备 (在试剂准备区进行)
(1) 推荐方式（内标对照质控核酸提取和核酸扩增过程）
取出试剂盒中的各组分以及自备试剂，室温放置，待温度平衡至室温，混匀后备用；
根据检测样品数量，建议每次检测均设置阴性对照和阳性对照。将所需数量（N）的GaPV PreMix-2分配到每个微离心管（如八连管）中，20 μL/管。待检样品数为n时，所需反应数N=样品数(n)+阳性对照(1)+阴性对照(1)；
当准备使用时，再转移到样品处理区。
(2) 其它方式（内标对照仅质控核酸扩增过程）
根据所检测的样品数量按照下表配制反应液，建议每次检测均设置阴性对照和阳性对照。待检样品数为n时， 需配制反应体系数N=待检样品数(n) +阳性对照(1)+阴性对照(1)+1。
*qPCR工作液配制表（其它方式）
组份 | 每反应体积(μL) |
GaPV PreMix-2 | 20 μL×N |
GaPV内标对照-2 | 0.5 μL×N |
*注：本配制方法为在提取样品核酸未加内标对照时的补救方法，不推荐。
将配制好的qPCR工作液充分混匀后瞬时离心，待用；当准备使用时，将等量的20 μL分配到每个微离心管（如八连管）中，并转移到样品处理区。
2、样品加样 (在样品处理区进行)
在每个PCR管中加入5 μL经提取的待测样品和阴性对照、阳性对照，盖上管盖， 瞬时离心，使液体全部沉于管底。
3、qPCR扩增 (在扩增与分析区进行)
(1) 荧光通道选择
荧光基团选择FAM通道检测GaPV；选择VIC 通道检测内标；淬灭基团设置为none。如ABI qPCR仪，还需设置Passive Reference为none。其它仪器参考仪器说明书。
(2) qPCR扩增程序设置
设置反应体系为25 μL。
步骤 | 温度 | 反应时间 | 循环 | |
UDG消化 | 50℃ | 5 min | 1 | |
预变性 | 95℃ | 30 sec | 1 | |
扩增 | 变性 | 95℃ | 5 sec | 45 |
退火与延伸 | 60℃ | 35 sec，数据收集 | ||
4、结果分析 (以ABI7500 qPCR仪为例)
反应结束后，qPCR仪将自动生成结果。若仪器自动生成的扩增曲线或阈值线有异常，用户可根据实际情况自行调整，基线Start值可以在 3~10，基线End值可设在 5~20，调整各扩增曲线的基线区相对水平即可。点击Analyze 进行分析。
5、质量控制
试剂盒中各控制项应符合下列要求，否则实验无效。
阳性对照 | 阴性对照 | |
FAM通道（GaPV） | Ct≦32 | 无Ct值或Ct>40 |
VIC通道 （内标） | 无Ct值或Ct>40 | 典型的S形曲线，Ct≦35 |
参考qPCR工作液配制表（其它方式）配制时，阳性对照的VIC通道应均出现S型曲线，Ct值≦35。
检验结果的解释
（1）若样品的VIC通道呈典型的S形曲线且Ct≦35时，
A. 当FAM通道Ct≦35，判定为GaPV阳性；
B. 当FAM通道Ct值在35到40之间时，需要观察靶基因的扩增曲线是否呈S形，如果曲线呈S形，样品应视为疑似GaPV阳性，需重新检测；复测结果若Ct值≦40且具有典型S形曲线，判定为GaPV阳性；反之若为无Ct显示、Ct>40或无典型S形曲线，则判定为GaPV阴性。
C. 当FAM通道Ct>40，判定为GaPV阴性。
（2）如果VIC通道的Ct值高于35，而没有显示明显的S形扩增曲线，原因如下：
1) 样品中存在PCR抑制剂，建议实验前稀释模板。
2) 核酸提取操作存在缺陷，建议重复核酸提取进行检测。
3) 在处理过程中没有获得合格的样品，或者在运输和储存过程中样品已经降解，建议重新采样。
检验方法的局限性
1) 阴性结果可能是由于从样品中提取的核酸质量低，储存条件不当，储存期不合适，样品中存在抑制剂，核酸降解和核酸提取方法的提取效率差等原因。
2) 不合理的样品采集、运送与保存条件，样品中病毒含量过低，或不合理的实验操作和环境很可能造成假阴性或假阳性结果。其它临床观察和相关资料应结合测定，必要时再次进行检测。
3) 由于突变或其它原因，靶序列的序列变化可能会产生假阴性结果。
注意事项：
1) 本产品仅用于科研使用，使用前请仔细阅读本说明书。
2) 实验前请熟悉和掌握需使用的各种仪器的操作方法和注意事项，对每次实验进行质量控制。
3) 实验室管理需严格遵照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行， 所有消耗品仅作一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用仪器和设备，各区各阶段用品不可交叉使用。
4) 所有检测样品均视为具有传染性的物质，实验过程中穿工作服并经常更换手套，以避免样品间的交叉污染；
5) 样品操作、废弃物处理应符合相关法规要求：《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理 条例》。
6) 所有试剂 (包括本产品中的组分与客户自备试剂) 使用前均需彻底化冻、混匀。
7) 血液类样品溶血严重时，会使扩增曲线高度显著下降。因此，当使用该试剂盒同时检测血液样品原液和生理盐水稀释 样品时，建议对2类模板分别设置不同的阈值线，以保证结果的准确性。
8) 当出现多个样品的Ct值>40时，可能是qPCR仪自动生成的阈值线较高的原因，建议将阈值线高度设置在扩增曲线 最大荧光值的1/15左右后，重新分析。
本产品仅供科研使用，检测结果不能用作临床诊断判断唯一依据
从2011年开始我们致力于在生命科学领域、生物医学实验技术及论文润色服务，协助客户各类实验服务及论文润色十多年，是您值得信赖的科研合作伙伴!
如果您受时间、试验条件等限制而无法完成您的课题研究，欢迎您与我们联系。
实验技术服务：
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