牛传染性胸膜肺炎检测试剂盒（实时荧光PCR法）说明书

【产品名称】

通用名称：牛传染性胸膜肺炎检测试剂盒（实时荧光PCR法）

英文名称：Contagious Bovine Pleuropneumonia (CBPP)Detecting Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】 25T/盒 ＆ 50T/盒

【预期用途】

本试剂盒利用改良分子信标实时荧光PCR原理，主要用于牛传染性胸膜肺炎的定性筛查检测。

【检验原理】

本试剂盒针对牛传染性胸膜肺炎基因设计特异性引物和探针，在反应体系中含有牛传染性胸膜肺炎 DNA模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。

【主要组成成份】

注：阴性对照为不含牛传染性胸膜肺炎核酸的其它菌的混合物，阳性对照为牛传染性胸膜肺炎经灭活处理的核酸提取物。

【储存条件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反复冻融，有效期12个月。

【适用仪器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、等多通道实时荧光定量PCR仪。

【样本要求】

1. 动物组织样本采集后取10mg～100mg用灭菌生理盐500μL～1000μL水研磨，离心后取上悬液备用，避免标本间交叉污染。

2. 标本收集后若不能立即检测，可置于2～8℃冷藏过夜保存；如需长期保存，标本应冻存于-20℃～-80℃，长期保存不会影响本试剂盒检测结果，但有可能影响培养法检测结果的准确性。

3. 标本保存期间应避免反复冻融。

【检验方法】

1. 试剂准备（试剂准备区）

（1）从冰箱中取出试剂盒, 从试剂盒中取出实验所需试剂，充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。

（2）核算当次实验所需要的反应数（n），并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。

n =阴性对照数（1T）+阳性对照数（1T）+误差预留量（1T）+样本数

(3)在无菌离心管中加入上述试剂，充分混匀后瞬时离心。按照20 μL/管分装量将试剂分装至PCR反应管。

(4) 盖紧PCR反应管盖后将PCR反应管和试剂盒中的DNA提取液转移至样本处理区。 剩余试剂放回-20℃以下冰箱冷冻保存。

2.样本准备（样本处理区）

用本公司病毒核酸提取试剂盒提取DNA，具体操作按照其试剂盒说明书操作。或按以下方法操作：

a.取试剂准备区传递过来的DNA提取液，2000 rpm 离心10 s后备用。

b.取样本自然沉降后的上清液1 mL，加入到1.5 mL无菌离心管中，12000 rpm离心5 min后，吸干上清，保留沉淀。

c.每管沉淀中加入DNA提取液50 μL，将沉淀悬浮后100℃加热处理5 min。

d.12000 rpm离心2 min，取上清用于PCR检测。

3.加样

在上述制备好的PCR反应样本管中分别加入处理好的待测标本DNA各5μl、终体积25μl/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上。阴性对照和阳性对照管则各加5μL试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品，终体积为25μl/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上。

4.PCR（PCR扩增区）

（1）取样本处理区准备好的PCR反应管，放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。

（2）按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行PCR扩增。

注：ABI系列荧光PCR仪在设置时不选ROX校正，设置淬灭基团选择None。

【阳性判断值或者参考区间】

1.试剂盒有效性判定：

（1）阳性对照：有典型S型扩增曲线或Ct值≤35。

（2）阴性对照：Ct值＞38或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。

2.标本结果判定：

（1）阳性：标本检测结果Ct值≤35或有明显指数增长期。

（2）可疑：标本检测结果Ct值在35～38范围内。此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果Ct值仍在35～38范围内，有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。

（3）阴性：标本检测结果Ct值＞38或无Ct值。

【检验结果的解释】

【检验方法的局限性】

• 当检测样本中被检核酸浓度含量低于本试剂盒的低检出*可能会发生假阴性的结果。
• 本试剂盒仅供标本初步筛查使用，对于本试剂盒检测阳性结果应进一步使用培养法进行确诊。

【产品性能指标】 产品的低检出限为10²CFU，产品CV值≤5%。

【注意事项】

• 整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区进行操作，各区实验服、仪器、耗材应独立使用，不能混用；实验用吸头采用带滤芯吸头；样本处理区应配有生物安全柜，样本处理在生物安全柜中进行操作；三个区应该配有紫外线杀菌装置。
• 每次实验应该设置阴、阳性对照。
• 为保证试剂不受标本污染，必须将DNA提取液、混合酶液及PCR反应液保存于试剂准备区。
• 试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀，并应瞬时离心。
• 试剂盒内所配阴性和阳性对照在di一次使用前应全部转移至标本准备区，并单独存放。
• 为防止荧光干扰，应避免裸手直接接触PCR反应管，并应避免在PCR反应管上进行任何标记。
• 仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置；不同批号试剂不能混用。
• ABI系列荧光定量PCR仪参数设置中不选ROX校正，淬灭基因选择None。
• 实验过程中产品的废弃物应该进行无害化处理后方可丢弃。
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