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OCT冰冻切片包埋剂(O.C.T. Compound)

OCT冰冻切片包埋剂是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，目前已广泛用于免疫组化实验中，其用途是在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连续性，减少皱折及碎裂。又回OCT混合物为水溶性，故在漂片时可溶于水，所以在以后的染色中不会增加背景染色。利用OCT混合物（opti-mum cutting temperature compound）预先浸润组织，然后再进行恒冷箱切片，使切片质量得到改善。

OCT包埋剂（SAKURA产品，MADE IN USA）包埋流程：

1，将放在蔗糖溶液中的组织块取出，放入20g　L-1　蔗糖与OCT包埋剂1：1体积比例混合液中，室温浸泡2h

2，移入OCT包埋剂中室温浸泡4h，更换新的OCT包埋剂，室温浸泡6h.

3，将标本置于托物台，用恒冷箱切片机切片（一般－22℃），片厚10μm,贴于预处理的载玻片上，－20℃冰箱保存。

组织采样

1.从每个福尔马林固定石蜡包埋的标本上切下50 µm的切片。每块标本至少要有两个切片，如果需要更多的细胞，则增加切片数量。每次从组织块取样之前和之后，按照5µm大小进一步分割，分出正常和恶性组织。

2.将分开的小切片放入10 mL管中。给管子贴上编号和「正常」「肿瘤」等标识

脱蜡

注意：在化学通风橱中执行以下脱蜡步骤。

1.通过向管中加入至少2至3 mL AmeriClear【AmeriClear histology clearing solvent (Scientific Products Cat. No. C4200-1)】，开始对切片进行脱蜡或脱蜡处理。在孵育步骤中，应有足够的试剂*覆盖石蜡切片。

2.剧烈涡旋震荡样品。与AmeriClear孵育的时间大约为10至15分钟，长为3小时。在移除试剂之前，请用移液管小心地将切片向上拉到试管的侧面，以保持组织完整。吸出剩余的试剂。

3.再加入2至3 mL AmeriClear，短暂涡旋，然后孵育10分钟。确保组织切片被试剂覆盖。流程如上所述。在进行复水步骤之前，请检查每个管子是否透明，这表明石蜡已*溶解。

复水

以下步骤对于组织的适当复水至关重要，如果执行不正确，可能会导致样品制备过程中碎屑增加。注意：在执行一个复水步骤时，如果酒精看起来浑浊或有明显的蜡沉淀存在，请通过在AmeriClear中孵育30分钟以除去残留的石蜡来除去酒精并执行额外的脱蜡步骤。然后继续补液步骤。

1.使用以下每种乙醇溶液3 mL：100％，95％，70％和50％的顺序洗涤，对切片进行复水。加入每种新的乙醇溶液后，涡旋标本，并在室温（20°至25°C）下孵育至少10分钟。在添加下一个溶液之前，先吸出每种溶液，在移液之前将切片向上拉到试管的侧面，以保持组织切片的完整性。注意：如果组织脆或很小，则可能很难将组织拉到管壁上。必须注意防止过多的细胞丢失。

2.加入3 mL纯水完成复水。轻轻吸取残留液体并加入纯水以消除残留的酒精。在室温（20°至25°C）下，将组织放在水中过夜。

解离

1.轻轻吸去纯水并重悬于2 mL 1X PBS中，同时准备胃蛋白酶（10分钟）。

2.轻轻吸出1X PBS，并在每个试管中加入至少2 mL新鲜制备的0.5％胃蛋白酶溶液。以中等速度涡旋约30秒，以确保组织被重悬。

3.将试管在37°C水浴中孵育1小时。每10分钟摇动或轻轻摇动试管一次，并检查上清液的浊度。对于某些组织，可能需要更长的孵育时间以增加细胞的回收率。一些组织，例如脾脏和淋巴结，可能只需要20分钟即可使上清液变浑浊。这也将取决于酶的活性。

染色

1.通过滤网过滤细胞悬液，用1-2 mL的1X PBS冲洗样品管一次，然后倒入滤网中。用尖头镊子挤压滤网以增加细胞产量。

2.在室温下（20°至25°C）以400 x g离心细胞悬液5分钟。小心除去上清液。

3.轻轻地将细胞沉淀重悬于1 mL的1X PBS中，并使用光学显微镜在血球计数器中计数细胞。将细胞浓度调整至大5.0 x 10E5细胞/mL。