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操作说明 细胞分离液试剂盒操作说明：：：：

Store at：：：RT 试剂盒规格：：：：2×100ml/Kit

人胰岛细胞分离液试剂盒试剂盒内容：

全血及组织稀释液 100ml

细胞洗涤液 100ml

试剂 B 100ml

试剂 D 100ml

说明书 1 份

一、、、、分离方法说明及图例

A. 在 10ml 或 15ml 玻璃离心管中依次小心加入 B、D 两种液体各 2ml,制成梯度界面（各液面分层一定要清晰）；

B．取 1ml新鲜抗凝血与全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）1：1混合并小心加于D液之液面上；或取组织匀浆单细胞悬液（细胞浓度为2×108-1×109个/ml，具体制备方法参照

“二、组织单细胞悬液的制备”）小心加于D液之液面上；

C. 以400g（约1500转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)；

此时离心管中由上至下细胞分为五层。*层；为血浆层或组织匀浆液层。第二层；为

富含胰岛细胞的 D 液层。。。。第三层；为单个核细胞层。第四层；为透明 B 液层。第五层；为红细胞层。收集第二层富含胰岛细胞的 富含胰岛细胞的 富含胰岛细胞的 D 液层放入含 4-5ml 细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以 500g（约 1800 转/分）离心 20 分钟，弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤 2 次即得所需胰岛细胞。

注：：：：A. 提取率约为 80%。

注：：：：A.. .. 本说明只提供机械匀浆制备单细胞悬液的方法 本说明只提供机械匀浆制备单细胞悬液的方法 本说明只提供机械匀浆制备单细胞悬液的方法，，，，酶消化法由于各实验室选取的消化 酶消化法由于各实验室选取的消化酶种类各不相同， 酶种类各不相同，，，请各实验室自行选择进行试验 请各实验室自行选择进行试验 请各实验室自行选择进行试验。。。。全过程及所需试剂要求无菌环境 全过程及所需试剂要求无菌环境 全过程及所需试剂要求无菌环境。。。。 剪碎法：：：：将组织块放入平皿后，加入少量组织匀浆液及 20%胎牛血清；用眼科剪将组织剪至匀浆状，加入 5ml 组织匀浆液及 20%胎牛血清；用吸管吸取组织匀浆，用 100 目不锈钢滤网

(另购)过滤到试管内；离心沉淀 1500转/分×3 min，再用细胞洗涤液清洗 3次，每次以 500rpm短时低速离心除去细胞碎片，以 200 目不锈钢滤网（另购）过滤去细胞团块。作细胞计数并调整细胞浓度为（2～5）×107个/ml。常温下放置, 待测细胞的活力。分离前用 20%胎牛血清或全血及组织稀释液悬起细胞浓度为 2×108-1×109个/ml 的单细胞悬液备用。

匀浆器法：用眼科剪将组织剪成小块；放入 70ml 组织研磨器内，加入 2ml 组织匀浆液及 20% 匀浆器法胎牛血清；缓慢转动研棒，研磨至匀浆；用 5ml 组织匀浆液及 20%胎牛血清冲洗研器；收集细胞悬液，经 200 目不锈钢滤网（另购）过滤；离心沉淀 800rpm×2min ，再用细胞洗涤液洗 3 次，离心沉淀。作细胞计数并调整细胞浓度为（2～5）×107个/ml。常温下放置, 待测细胞的活力。分离前用 20%胎牛血清或全血及组织稀释液悬起细胞浓度为 2×108-1×109 个/ml 的单细胞悬液备用。 细胞计数方法: 细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般利用计数板（血球计数板）进行。既可用于分离（散）细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于

对培养物的细胞数量进行计数。不论计数的对象如何，均须制备分散的细胞悬液。

1）、在细胞计数板中央放置计数的盖玻片。

2）、用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流出悬液，至

盖玻片被液体充满为止。

3）、置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线者，

对于细胞团按单个细胞计数。

4）、按下式计数细胞悬液的密度：

细胞密度＝（4 个大格细胞总数/4）×104个/ml×稀释倍数

公式中乘以 104因为计数板中每一个大格的体积为：

1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3

 而 1ml＝1000mm3

细胞计数要点：：：：

A． 进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于 104个/ml，如果细胞数目很少要进行离

心再悬浮于少量培养液中；显微镜下计数时，遇到 2 个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如果细胞团>10％，说明细胞分散不充分; 或细胞数<200 个/10mm2或>500 个/10 mm2 时，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液。

B． 要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。

C． 取样前充分混匀细胞悬液，尤其多次取样更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；

D． 数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细

胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。

E． 操作时，注意盖玻片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。

初学者易犯的错误： 初学者易犯的错误：：：

A． 计数前未将待测悬液吹打均匀。

B． 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。

C． 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。

三、、、、注意事项

A． 本分离液是敏光型的，运输和贮藏过程中在 18℃-25℃避光保存，启封后 4℃保存本品只能用于科学研究，不能用于临床检测

避免微生物污染。本品为真空包装，未启封前于 10℃ 以下易出现白色结晶，影响分离效果。

B． 待分离的血液及组织样本要求新鲜，避免冷冻和冷藏。分离液和所分离样本一定在

20℃水浴箱中复温 20 分钟保证分离液和所分离样本温度在 20℃±2℃时分离效果，且

所有操作过程一定要在无菌条件下进行。

C． 由于各品牌离心机的性能不同，国内南北地区温度环境和四季差异，可能影响分离

效果，用户可调节离心转数及离心时间，摸索*的分离条件（具体分离条件各实验室自定）。

D． 使用无静电反应的离心管，推荐使用未经过碱处理的玻璃离心管。

E． *抗凝剂选择：EDTA、枸橼酸、肝素。注意在血液稀释过程中应去除抗凝剂体积。

F． 分离过程中所用其他试剂如：羟乙一基淀粉 550、全血及组织稀释液、细胞洗涤液及

红细胞裂解液等以我公司产品为*选择，本公司相关系列产品无菌、无病毒、无支原体、

低内毒素水平且无细胞毒性，所获得的细胞可保持完好的生物活性和完整的细胞形态。

四、、、、 产品性能指标

pH 7.0-7.5

渗透压 280-340mOsmol/kg

内毒素 ≤0.5...EU/ml

无菌 直接接种培养 14 天后培养基澄清

澄明度及不溶性颗粒物 每 50ml 溶液中含 10μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 20 粒以下含 25μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 5 粒以下

五、、、、 贮藏及保存期限 贮藏及保存期限 贮藏及保存期限

18℃-25℃避光保存，有效期两年。启封后置 4℃保存，有效期一周。

注：：：：若保证无微生物污染，启封后可置 4℃长期保存。但应注意保存温度较低时本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。

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