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一、孔雀石绿快速检测试剂盒原理

本试剂盒采用间接竞争 ELISA 方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物孔雀石绿将和 微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗孔雀石绿抗体， 加入酶标记物后，用 TMB 底物显色，样本吸光值 与其所含残留物孔雀石绿的含量成负相关，与标准 曲线比较即可得出相应残留物孔雀石绿的含量。

二、孔雀石绿快速检测试剂盒特性

试剂盒灵敏度：  0.05ppb

孵育温度：    25℃

孵育时间：    30min～30min～15min

样本检测限

水样 ———————— 0.1ppb

水产品 ·——————+—— 0.5ppb

• 交叉反应率

• 样本回收率

水样、水产品 ————————  80%~110%

• 精密度

板内、板间变异系数≤12%

三、试剂盒组成

四、所用仪器、试剂

具备的仪器：酶标仪、均质器、振荡器、离心机、 刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮 吹仪、恒温箱微量移液器：单道 20～200µl、单道 100～1000µl、多道 30～300 µl

试 剂：乙腈、二氯甲烷、无水硫酸钠、正己烷

五、样本前处理步骤

样本处理前须知

（a）实验中必须使用一次性吸头，吸取不同试 剂时要更换吸头。

（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净， 必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实 验结果。

 样本前处理需配制： 配液 1 样品提取液乙腈-二氯甲烷混合溶液：

V 乙腈-V 二氯甲烷 = 4 : 1，取 40ml 乙腈， 再加入 10ml 二氯甲烷，混匀后使用。

配液 2 样品复溶液

将 4X 浓缩复溶液用去离子水按 1：3 稀释 （1 份 4×浓缩复溶液+3 份去离子水），或按所需用 量配制。

 样本处理：

（a）水样处理方法

取 50µl 清澈水样样直接测定（如果水样浑浊 一定要过滤或 4000r/min 离心 10min，直至得到 清澈样），暂不使用的样本应冷冻保存。

样本稀释倍数:  1 倍

（b）水产品处理方法

1、称取 2±0.05g 均质组织样品于 50ml 离心管中， 加入 6ml 样品提取液（配液 1），2g 无水硫酸 钠，振荡 5min ，室温（25℃左右）4000r/min以上离心 10min；

2、取 3ml 上清液，加入 20µl 氧化剂，摇匀，在 56℃ 条件下氮气或空气流吹至*干燥；

3、加入 1ml 正己烷，加入 1ml 样品复溶液（配液2），振荡摇匀 1min，4000r/min 以上离心 5min；

4、取下层 50 µl 用于分析；

样本稀释倍数:  1 倍

注：此方法所得到的结果为孔雀石绿；隐性孔 雀石绿；结晶紫；隐性结晶紫的总量。

六、酶标免疫分析程序:

测定前应须知：

1、 使用前将需用试剂和板条的温度回升至室温 （20～25℃）。

2、 使用之后立即将所有试剂放回 2～8℃。

3、 在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于 洗板的*性，正确的洗板操作是 ELISA 测定 程序中的要点。

4、 所有恒温孵育过程，避免光线照射，用盖板膜 盖住微孔板。

操作步骤：

1、从 2～8℃冷藏环境中取出所需试剂，室温（20～ 25℃）平衡 30min 以上，注意每种液体试剂使 用前均须摇匀。

2、取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放 入自封袋，保存于 2-8℃。

3、配液 1：将 40ml 浓缩洗涤液（20 倍浓缩）用去 离子水按照 1：19 稀释（1 份浓缩洗涤液+19 份 去离子水），或按所需用量配制洗涤液。

配液 2：

配制孔雀石绿标准液：取一定量的 10 倍浓缩

标准液用样品复溶液 10 倍稀释，现配现用， 具体如下：

标准液6：配制4.05ppb 标准液--取50ul 40.5ppb标准液加 450ul 样品复溶液混匀；

标准液5：配制1.35ppb 标准液--取50ul 13.5ppb标准液加 450ul 样品复溶液混匀；

标准液 4：配制 0.45ppb 标准液--取 50ul 4.5ppb标准液加 450ul 样品复溶液混匀；

标准液 3：配制 0.15ppb 标准液--取 50ul 1.5ppb标准液加 450ul 样品复溶液混匀；

标准液 2：配制 0.05ppb 标准液--取 50ul 0.5ppb标准液加 450ul 样品复溶液混匀；

标准液 1：配制 0ppb 标准液--取 50ul 0ppb 标准液加 450ul 样品复溶液混匀；

4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每 个样本和标准品做 2 孔平行，并记录标准孔和 样本孔所在的位置。

5、加标准品/样本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加 入抗体工作液 50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻振 荡混匀。25℃环境中反应 30min。

6、将孔内液体甩干，用已稀释的洗涤液 250µl/孔 洗板 4～5 次，每次间隔 15～30 秒，用吸水纸 拍干（拍干后未清除的气泡可用干净的枪头刺 破）。

7、每孔加入酶标记物 100µl，盖板膜盖板后置25℃ 环境中反应 30min。将孔内液体甩干，用洗涤 液充分洗，4～5 遍（同上），用吸水纸拍干（拍 干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

8、显色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B 液 50µl/孔，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显 色 15min。

9、测定：加入终止液 50µl/孔，轻轻振荡混匀，设 定酶标仪于 450nm 处（建议用双波长 450/630n m 检测，5min 内读数），测定每孔 OD 值。

七、结果判定

结果判定有两种方法，粗略判定可用第 1 种方 法，定量判定用第 2 种方法。注意样本吸光度值与 其所含孔雀石绿量成负相关。

1、粗略判定：

用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出 其浓度范围(ng/ml)。假设样本 1 的吸光度值为 0.3， 样本 2 的吸光度值为 1.0，标准液吸光度值分别是：

0ppb 为 2.243；0.05ppb 为 1.816；0.15ppb 为 1.415； 变质。

0.45ppb 为 0.74；1.35ppb 为 0.313；4.05ppb 为 0.155。  8、该试剂盒佳反应温度为 25℃，温度过高或过则样本 1 的浓度范围是 1.35ppb～4.05ppb；样本 2的浓度范围是 0.15ppb～0.45ppb，乘以其对应的稀 释倍数即为样本中孔雀石绿实际浓度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分 吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值（双 孔）除以*个标准（0 标准）的吸光度值，再乘 以 100%，即

B

百分吸光率（%）＝ ×100% B0

低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

九、储藏条件和保质期

1、储藏条件：试剂盒于 2-8℃保存，不要冷冻。 2、保 质 期：该产品有效期为 1 年，生产日期见

包装盒。

提示：酶标板真空包装袋若有漏气，酶标板仍然正 常有效，不影响实验结果，请放心使用。

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml 标准溶液的平均吸光度值

（2）标准曲线的绘制与计算 以标准品百分吸光率为纵坐标，以孔雀石绿标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲 线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标 准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀 释倍数即为样本中孔雀石绿实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于 大量样本的准确、快速分析。

八、 注意事项

1、室温低于 25℃或试剂及标本未回到室温（20～25℃）会导致所有标准的 OD 值偏低。

2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会 伴随着标准曲线不成线性，重复性不好的现象。 所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、反应终止液为 2M 硫酸，避免接触皮肤。

5、不要使用过了有效日期的试剂盒；稀释或搀杂 使用会引起灵敏度、OD 值变化；不要交换使用 不同批号的盒中试剂。

6、不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质 和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴 露在光线下。

7、显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。标 准品 1 的吸光度值小于 0.5 时，表示试剂可能